Благодарим вас за посещение www.chinacdoe.com.Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS.Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Системы «лаборатория на чипе» с возможностью выезда на место предлагают возможность быстрой и точной диагностики и полезны в условиях ограниченных ресурсов, где нет биомедицинского оборудования и обученных специалистов.Однако создание системы тестирования на месте оказания медицинской помощи, которая одновременно обладает всеми необходимыми функциями для многофункционального дозирования, выпуска по требованию, надежной работы и длительного хранения реагентов, остается серьезной проблемой.Здесь мы описываем технологию микропереключателя хода с рычажным приводом, которая может манипулировать жидкостями в любом направлении, обеспечивать точную и пропорциональную реакцию на приложенное давление воздуха и оставаться устойчивой к резким движениям и вибрациям.На основе этой технологии мы также описываем разработку системы полимеразной цепной реакции, которая объединяет введение реагентов, смешивание и функции реакции в одном процессе, что обеспечивает эффективность «образец в ответ» для всех клинических образцов из носа от 18 пациентов с Грипп и 18 отдельных контролей, в хорошем соответствии интенсивности флуоресценции со стандартной полимеразной цепной реакцией (коэффициенты Пирсона> 0,9).На основе этой технологии мы также описываем разработку системы полимеразной цепной реакции, которая объединяет введение реагентов, смешивание и функции реакции в одном процессе, что обеспечивает эффективность «образец в ответ» для всех клинических образцов из носа от 18 пациентов. с гриппом и 18 отдельными контрольными группами, в хорошем соответствии интенсивности флуоресценции со стандартной полимеразной цепной реакцией (коэффициенты Пирсона > 0,9).В основе этой технологии мы также описываем конфигурацию системы полимеразной цепочки, которая определяет функцию подачи реагентов, вращений и реакции в одном процессе, что обеспечивает достижение «образец-в-ответ-выход» для всех образцов из носа от 18 пациентов с Гриппом. и 18 отдельных контролей, в соответствии с хорошим уровнем флуоресценции со смесью полимеразной цепной реакции (коэффициент Пирсона > 0,9).На основе этой технологии мы также описываем разработку системы полимеразной цепной реакции, которая сочетает в себе функции инъекции, смешивания и реакции в едином процессе, что позволяет брать образцы в ответ для всех клинических образцов из носа от 18 пациентов с гриппом.и 18 индивидуальных контролей, что хорошо согласуется со стандартной интенсивностью флуоресценции полимеразной цепной реакции (коэффициенты Пирсона > 0,9).На основе этой технологии мы также описываем разработку системы полимеразной цепной реакции, которая объединяет функции инъекции реагента, смешивания и реакции для анализа всех клинических образцов носа из 18 образцов носа, взятых у пациентов в образце. Грипп и 18 индивидуальных контролей, интенсивность флуоресценции подобрана. хорошо справляется со стандартной полимеразной цепной реакцией (коэффициент Пирсона > 0,9).Предлагаемая платформа гарантирует надежную автоматизацию биомедицинского анализа и, таким образом, может ускорить коммерциализацию ряда устройств для тестирования на местах.
Новые заболевания человека, такие как пандемия COVID-19 2020 года, унесшая жизни миллионов людей, представляют серьезную угрозу глобальному здравоохранению и человеческой цивилизации1.Раннее, быстрое и точное выявление заболеваний имеет решающее значение для контроля распространения вируса и улучшения результатов лечения.Основная диагностическая экосистема, основанная на централизованных лабораториях, где образцы тестов отправляются в больницы или диагностические клиники и управляются профессионалами, в настоящее время ограничивает доступ почти 5,8 миллиарда человек во всем мире, особенно тех, кто живет в условиях ограниченных ресурсов.где не хватает дорогостоящего биомедицинского оборудования и квалифицированных специалистов.клиницисты 2. Таким образом, существует острая необходимость в разработке недорогой и удобной в использовании системы «лаборатория на чипе» с возможностью тестирования на месте оказания медицинской помощи (POCT), которая может предоставить врачам своевременную диагностическую информацию для принятия обоснованных диагностических решений. .и лечение 3.
В рекомендациях Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) говорится, что идеальный POCT должен быть доступным, удобным (простым в использовании при минимальном обучении), точным (избегать ложноотрицательных или ложноположительных результатов), быстрым и надежным (обеспечивать хорошие свойства повторяемости) и доставляемый (способный к долгосрочному хранению и легко доступный для конечных пользователей)4.Чтобы соответствовать этим требованиям, системы POCT должны обеспечивать следующие функции: универсальное дозирование для уменьшения ручного вмешательства, высвобождение по требованию для масштабирования транспортировки реагентов для получения точных результатов испытаний и надежная работа, позволяющая выдерживать вибрацию окружающей среды.В настоящее время наиболее широко используемым устройством POCT является полоска с боковым потоком5,6, состоящая из нескольких слоев пористых нитроцеллюлозных мембран, которые выталкивают очень небольшое количество образца вперед, реагируя с предварительно иммобилизованными реагентами под действием капиллярной силы.Несмотря на то, что устройства POCT на основе проточной полоски обладают преимуществом низкой стоимости, простоты использования и быстрых результатов, их можно использовать только для биологических тестов (например, тестов на глюкозу7,8 и тестов на беременность9,10), не требуя многоэтапных анализов.реакции (например, загрузка нескольких реагентов, смешивание, мультиплексирование).Кроме того, движущие силы, которые контролируют движение жидкости (т.е. капиллярные силы), не обеспечивают хорошей согласованности, особенно между партиями, что приводит к плохой воспроизводимости11 и делает полосы бокового потока в первую очередь полезными для хорошего обнаружения12,13.
Расширенные производственные возможности в микро- и наномасштабе создали возможности для разработки микрофлюидных устройств POCT для количественных измерений14,15,16,17.Регулируя свойства интерфейса 18, 19 и геометрию каналов 20, 21, 22, можно управлять капиллярной силой и скоростью потока этих устройств.Однако их надежность, особенно для сильносмачиваемых жидкостей, остается неприемлемой из-за погрешностей изготовления, дефектов материалов и чувствительности к вибрациям окружающей среды.Кроме того, поскольку на границе раздела жидкость-газ создается капиллярный поток, дополнительный поток не может быть введен, особенно после заполнения микрофлюидного канала жидкостью.Следовательно, для более сложного обнаружения необходимо выполнить несколько этапов введения пробы24,25.
Среди микрофлюидных устройств центробежные микрофлюидные устройства в настоящее время являются одним из лучших решений для POCT26,27.Преимущество его приводного механизма состоит в том, что движущую силу можно контролировать путем регулирования скорости вращения.Однако недостатком является то, что центробежная сила всегда направлена к внешнему краю устройства, что затрудняет реализацию многоступенчатых реакций, необходимых для более сложных анализов.Хотя для многофункционального дозирования в дополнение к центробежной силе вводятся дополнительные движущие силы (например, капилляры 28, 29 и многие другие 30, 31, 32, 33, 34, 35), непредвиденный перенос жидкости все же может произойти, поскольку эти дополнительные силы обычно имеют порядок по величине ниже, чем центробежная сила, что делает их эффективными только в небольших рабочих диапазонах или недоступными по требованию при выпуске жидкости.Включение пневматических манипуляций в центробежную микрофлюидику, таких как центробежные кинетические методы 36, 37, 38, термопневматические методы 39 и активные пневматические методы 40, оказалось привлекательной альтернативой.При контрфугодинамическом подходе в устройство интегрируют дополнительную полость и соединительные микроканалы как внешнего, так и внутреннего воздействия, хотя эффективность его откачки (в диапазоне от 75% до 90%) сильно зависит от количества циклов откачки и вязкости. жидкости.В термопневматическом методе латексная мембрана и камера передачи жидкости специально разработаны для герметизации или повторного открытия впускного отверстия, когда объем захваченного воздуха нагревается или охлаждается.Однако установка нагрева/охлаждения создает проблемы с медленным откликом и ограничивает ее использование в термочувствительных анализах (например, амплификация полимеразной цепной реакции (ПЦР)).При активном пневматическом подходе освобождение по требованию и движение внутрь достигаются за счет одновременного применения положительного давления и точно подобранной скорости вращения высокоскоростными двигателями.Существуют и другие успешные подходы, использующие только пневматические приводы (положительное давление 41, 42 или отрицательное давление 43) и нормально закрытые конструкции клапанов.Путем последовательного приложения давления в пневматической камере жидкость перистальтически перекачивается вперед, а нормально закрытый клапан предотвращает обратный поток жидкости из-за перистальтики, тем самым реализуя сложные операции с жидкостью.Однако в настоящее время существует лишь ограниченное количество микрофлюидных технологий, которые могут выполнять сложные операции с жидкостями в одном устройстве POCT, включая многофункциональное дозирование, выпуск по требованию, надежную работу, длительное хранение, обработку жидкостей высокой вязкости и т. д. и экономически эффективное производство.Все одновременно.Отсутствие многоэтапной функциональной операции также может быть одной из причин того, что на сегодняшний день на открытом рынке успешно представлены лишь несколько коммерческих продуктов POCT, таких как Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat и Rhonda.
В этой статье мы предлагаем пневматический микрофлюидный привод на основе технологии микропереключателей с зеленым кольцом (FAST).FAST сочетает в себе все необходимые свойства одновременно для широкого спектра реагентов от микролитров до миллилитров.FAST состоит из эластичных мембран, рычагов и блоков.Без применения давления воздуха мембраны, рычаги и блоки могут быть плотно закрыты, а жидкость внутри может храниться в течение длительного времени.Когда прикладывается соответствующее давление и регулируется длина рычага, диафрагма расширяется и толкает рычаг в открытое положение, позволяя жидкости проходить через него.Это позволяет осуществлять многофункциональное дозирование жидкостей каскадным, одновременным, последовательным или выборочным способом.
Мы разработали систему ПЦР с использованием FAST для получения результатов ответа в образце для обнаружения вирусов гриппа А и В (IAV и IBV).Мы достигли нижнего предела обнаружения (LOD) 102 копий/мл, наш мультиплексный анализ показал специфичность к IAV и IBV и позволил провести патотипирование вируса гриппа.Результаты клинических испытаний с использованием мазков из носа у 18 пациентов и 18 здоровых людей показывают хорошее соответствие интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Результаты клинических испытаний с использованием мазков из носа у 18 пациентов и 18 здоровых людей показывают хорошее соответствие интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Результаты применения образца мазки из носа у 18 пациентов и 18 здоровых лиц показывают хорошее соответствие частоты ресценции режима флОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).Результаты клинических исследований с использованием мазка из носа у 18 пациентов и 18 здоровых лиц показывают хорошее соответствие интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).0,9）。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 Результаты применения образцов назальных мазков у 18 пациентов и 18 здоровых лиц показали хорошее соответствие между включением флуоресценции и включением ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).Результаты клинических исследований с использованием мазков из носа у 18 пациентов и 18 здоровых лиц показали хорошее соответствие интенсивности флуоресценции и стандартной ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).Ориентировочная стоимость материала устройства FAST-POCT составляет примерно 1 доллар США (дополнительная таблица 1) и может быть дополнительно снижена за счет использования методов крупномасштабного производства (например, литья под давлением).Фактически, устройства POCT на основе FAST обладают всеми необходимыми функциями, предусмотренными ВОЗ, и совместимы с новыми методами биохимического тестирования, такими как термоциклирование плазмы44, иммуноанализы без амплификации45 и тесты функционализации нанотел46, которые являются основой систем POCT.возможность.
На рис.1а показана конструкция платформы FAST-POCT, которая состоит из четырех камер для жидкости: камеры предварительного хранения, камеры смешивания, реакционной камеры и камеры отходов.Ключом к управлению потоком жидкости является конструкция FAST (состоящая из эластичных мембран, рычагов и блоков), расположенная в камере предварительного хранения и камере смешивания.В качестве метода с пневматическим приводом конструкция FAST обеспечивает точное управление потоком жидкости, включая переключение «закрыто/открыто», универсальное дозирование, выпуск жидкости по требованию, надежную работу (например, нечувствительность к вибрации окружающей среды) и длительное хранение.Платформа FAST-POCT состоит из четырех слоев: подложки, слоя эластичной пленки, слоя пластиковой пленки и покровного слоя, как показано в увеличенном виде на рис. 1b (также подробно показано на дополнительных рисунках S1 и S2). ).Все каналы и камеры транспортировки жидкости (например, камеры предварительного хранения и реакционные камеры) встроены в подложки PLA (полимолочная кислота) толщиной от 0,2 мм (самая тонкая часть) до 5 мм.Эластичный пленочный материал представляет собой ПДМС толщиной 300 мкм, который легко расширяется под давлением воздуха благодаря своей «малой толщине» и низкому модулю упругости (около 2,25 МПа47).Слой полиэтиленовой пленки изготовлен из полиэтилентерефталата (ПЭТ) толщиной 100 мкм для защиты эластичной пленки от чрезмерной деформации под давлением воздуха.В соответствии с камерами слой подложки имеет рычаги, соединенные шарнирами с покровным слоем (из PLA) для управления потоком жидкости.Эластичная пленка была приклеена к подложке с помощью двустороннего скотча (ARseal 90880) и покрыта полиэтиленовой пленкой.Три слоя были собраны на подложке с использованием Т-образного зажима в покровном слое.Т-образный зажим имеет зазор между двумя ножками.Когда зажим был вставлен в паз, две ножки слегка согнулись, затем вернулись в исходное состояние и плотно скрепили крышку и подложку, когда они проходили через паз (дополнительный рисунок S1).Затем четыре слоя собираются с помощью соединителей.
Схематическая диаграмма платформы, иллюстрирующая различные функциональные отсеки и особенности FAST.б Увеличенная схема платформы FAST-POCT.c Фотография платформы рядом с монетой в четверть доллара США.
Рабочий механизм платформы FAST-POCT показан на рисунке 2. Ключевыми компонентами являются блоки базового слоя и шарниры защитного слоя, что приводит к интерференционной конструкции, когда четыре слоя собираются с использованием Т-образной формы. .При отсутствии давления воздуха (рис. 2а) посадка с натягом приводит к изгибу и деформации шарнира, а через рычаг прикладывается уплотняющее усилие, прижимающее эластичную пленку к блоку, и определяется жидкость в полости уплотнения. как закрытое государство.Следует отметить, что в этом состоянии рычаг изогнут наружу, как показано на виде сбоку на рис. 2а.При подаче воздуха (рис. 2б) эластичная мембрана расширяется наружу в сторону крышки и толкает рычаг вверх, открывая тем самым зазор между рычагом и блоком для перетекания жидкости в следующую камеру, что определяется как открытое состояние. .После сброса давления воздуха рычаг может вернуться в исходное положение и оставаться натянутым за счет упругости шарнира.Видео движений рычага представлено в дополнительном фильме S1.
A. Принципиальная схема и фотографии в закрытом состоянии.При отсутствии давления рычаг прижимает мембрану к блоку, и жидкость герметизируется.б В хорошем состоянии.При приложении давления мембрана расширяется и толкает рычаг вверх, поэтому канал открывается и жидкость может течь.в Определить характерную величину критического давления.К характерным размерам относятся длина рычага (L), расстояние между ползунком и шарниром (l) и толщина выступа рычага (t).Fs — сила уплотнения в точке дросселирования B. q — равномерно распределенная нагрузка на рычаг.Tx* представляет крутящий момент, развиваемый шарнирным рычагом.Критическое давление — это давление, необходимое для подъема рычага и обеспечения потока жидкости.г Теоретические и экспериментальные результаты зависимости критического давления от размера элемента.Было проведено n = 6 независимых экспериментов, данные представлены как ± стандартное отклонение.Необработанные данные представлены в виде файлов необработанных данных.
Разработана аналитическая модель на основе балочной теории для анализа зависимости критического давления Pc, при котором открывается зазор, от геометрических параметров (например, L – длина рычага, l – расстояние между блоком и балкой). шарнир, S – рычаг. Площадь контакта с жидкостью t – толщина выступа рычага, как показано на рис. 2в).Как подробно описано в дополнительных примечаниях и на дополнительном рисунке S3, зазор открывается, когда \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), где Fs — крутящий момент \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\) для устранения сил, связанных с посадкой с натягом и вызывающих изгиб шарнира.Экспериментальный отклик и аналитическая модель показывают хорошее согласие (рис. 2d), показывая, что критическое давление Pc увеличивается с увеличением t/l и уменьшением L, что легко объясняется классической моделью балки, т.е. крутящий момент увеличивается с увеличением t /Lift. .Таким образом, наш теоретический анализ ясно показывает, что критическим давлением можно эффективно управлять, регулируя длину рычага L и соотношение t/l, что обеспечивает важную основу для проектирования платформы FAST-POCT.
Платформа FAST-POCT обеспечивает многофункциональное дозирование (показано на рисунке 3а со вставкой и экспериментом), что является наиболее важной особенностью успешного POCT, при котором жидкости могут течь в любом направлении и в любом порядке (каскадно, одновременно, последовательно) или избирательно многоканально. выдача .– функция дозирования.На рис.3a(i) показан каскадный режим дозирования, в котором две или более камер соединены каскадно с использованием блоков для разделения различных реагентов и рычага для управления открытым и закрытым состояниями.При приложении давления жидкость перетекает из верхней камеры в нижнюю каскадным образом.Следует отметить, что каскадные камеры могут быть заполнены влажными химикатами или сухими химикатами, такими как лиофилизированные порошки.В эксперименте на рис. 3а(i) красные чернила из верхней камеры перетекают вместе с порошком синего красителя (сульфат меди) во вторую камеру и становятся темно-синими, когда достигают нижней камеры.Он также показывает управляющее давление перекачиваемой жидкости.Аналогично, когда один рычаг соединен с двумя камерами, происходит режим одновременного впрыска, как показано на рис.3a(ii), в которой жидкость может быть равномерно распределена по двум или более камерам при приложении давления.Поскольку критическое давление зависит от длины рычага, длину рычага можно регулировать для достижения последовательной схемы впрыска, как показано на рис.3а(iii).Длинный рычаг (с критическим давлением Pc_long) был подключен к камере B, а короткий рычаг (с критическим давлением Pc_short > Pc_long) был подключен к камере A. Поскольку давление P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) было приложено, только жидкость, выделенная красным может течь в камеру B, и когда давление увеличивается до P2 (> Pc_short), синяя жидкость может течь в камеру A. Этот режим последовательного впрыска применяется к различным жидкостям, последовательно перемещающимся в соответствующие камеры, что имеет решающее значение для успешного POCT. устройство.Длинный рычаг (с критическим давлением Pc_long) был подключен к камере B, а короткий рычаг (с критическим давлением Pc_short > Pc_long) был подключен к камере A. Поскольку давление P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) было приложено, только жидкость, выделенная красным может течь в камеру B, и когда давление увеличивается до P2 (> Pc_short), синяя жидкость может течь в камеру A. Этот режим последовательного впрыска применяется к различным жидкостям, последовательно перемещающимся в соответствующие камеры, что имеет решающее значение для успешного POCT. устройство.Длинный рычаг (с крайним рычагом Pc_long) был соединен с разъемом B, а короткий рычаг (с крайним рычагом Pc_short > Pc_long) был соединен с разъемом A. При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) только жидкость, выделенная красным, может течь в камера B, и когда давление увеличилось до P2 (> Pc_short), синяя жидкость может течь в камере A. В этом режиме непрерывного впрыска применяются различные жидкости, постоянно перемещаемые в соответствующие камеры, что имеет решающее значение для успешной POCT.Длинный рычаг (с критическим давлением Pc_long) был подключен к камере B, а короткий рычаг (с критическим давлением Pc_short > Pc_long) был подключен к камере A. При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) выделяется только жидкость. красный цвет может течь в камеру B, а когда давление увеличивается до P2 (> Pc_short), синяя жидкость может течь в камеру A. Этот режим последовательного впрыска применяется к различным жидкостям, последовательно перекачиваемым в соответствующие камеры, что имеет решающее значение. для успешного POCT.устройство. Длинный рычаг (критическое давление Pc_long) соединяется с выключателем B, короткий рычаг (критическое давление Pc_short > Pc_long) соединяется с выключателем A.Длинное плечо (критическое давление Pc_long) соединено с камерой B, а короткое плечо (критическое давление Pc_short > Pc_long) соединено с камерой A.При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) в камере B может повернуть только красная жидкость, а при увеличении давления до P2 (> Pc_short) в камере A может повернуть синюю жидкость.При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) только красная жидкость может попасть в камеру B, а когда давление увеличивается до P2 (> Pc_short), синяя жидкость может попасть в камеру A. Этот режим последовательного впрыска подходит для последовательной перекачки различные жидкости в соответствующие камеры, что имеет решающее значение для успешной работы устройства POCT.На рис. 3а(iv) показан режим избирательного впрыска, при котором основная камера имела короткий (с критическим давлением Pc_short) и длинный рычаг (с критическим давлением Pc_long < Pc_short), которые дополнительно подключались к камере A и камере B соответственно. в другой воздушный канал, соединенный с камерой B. Чтобы перекачать жидкость сначала в камеру A, к устройству одновременно подавалось давление P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) и P2 (P2 > P1) с P1 + P2 > Pc_short.На рис. 3а(iv) показан режим избирательного впрыска, при котором основная камера имела короткий (с критическим давлением Pc_short) и длинный рычаг (с критическим давлением Pc_long < Pc_short), которые дополнительно подключались к камере A и камере B соответственно. в другой воздушный канал, соединенный с камерой B. Чтобы перекачать жидкость сначала в камеру A, к устройству одновременно подавалось давление P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) и P2 (P2 > P1) с P1 + P2 > Pc_short.На рис.3а(iv) показан режим селективного впрыска, при котором основная камера имела короткий (с крайним разрядом Pc_short) и длинный рычаг (с крайним рычагом Pc_long < Pc_short), которые дополнительно соединялись с электрической розеткой A и розеткой B соответственно.3а(iv) показан режим избирательного впрыска, при котором основная камера имела короткий (с критическим давлением Pc_short) и длинный рычаг (с критическим давлением Pc_long < Pc_short), которые дополнительно были подключены к камере А и камере Б соответственно.во время воздушного канала, соединенного с выключателем B. Чтобы передать сначала жидкость в камеру A, к устройству одновременно прикладывали давление P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) и P2 (P2 > P1), где P1 + P2 > Pc_short.в другой воздушный канал, соединенный с камерой B. Чтобы сначала перекачать жидкость в камеру A, к устройству одновременно были приложены давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) и P2 (P2 > P1), где P1 + P2 > Pc_short. 3а(iv) показан режим селективного впрыска, когда основная камера имеет короткую стержень (с предельным давлением Pc_short) и длинную стержень (с крайним давлением Pc_long < Pc_short), соединенные с электрической розеткой A и электрической розеткой B слева, и в дополнение к происходящему воздушному каналу, подключенному помещению Б.3a(iv) показан режим избирательного впрыска, когда основная камера имеет короткий шток (критическое давление Pc_short) и длинный шток (критическое давление Pc_long < Pc_short), соединенные с камерой A и камерой B соответственно, и в дополнение к другому проходу для воздуха. соединен с комнатой Б.Таким образом, P2 предотвращает попадание жидкости в камеру B;в то же время общее давление P1 + P2 превысило критическое давление для активации более короткого рычага, соединенного с камерой A, чтобы обеспечить поток жидкости в камеру A. Затем, когда требуется заполнить камеру B, нам нужно только применить P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) в основной камере, чтобы активировать длинный рычаг и позволить жидкости течь в камеру B. В период времени от t = 3 с до 9 с можно четко наблюдать, что жидкость в камере A оставалась постоянной, в то время как она увеличивалась в камере. B, когда было приложено давление P1.в то же время общее давление P1 + P2 превысило критическое давление для активации более короткого рычага, соединенного с камерой A, чтобы обеспечить поток жидкости в камеру A. Затем, когда требуется заполнить камеру B, нам нужно только применить P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) в основной камере, чтобы активировать длинный рычаг и позволить жидкости течь в камеру B. В период времени от t = 3 с до 9 с можно четко наблюдать, что жидкость в камере A оставалась постоянной, в то время как она увеличивалась в камере. B, когда было приложено давление P1.Между тем общее давление P1 + P2 превысило критическое давление, чтобы создать более короткий рычаг, соединенный с активным разрядником A, чтобы позволить жидкости течь в камере A. Затем, когда требуется заполнить камеру B, нам нужно применить только P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) в основной камере, чтобы активировать длинный рычаг и дать жидкости течь в камеру B. Можно ясно наблюдать, что в период с t = 3 с до 9 с жидкость в камере A сохраняла постоянство, в то время как в камере она увеличивалась.Между тем, общее давление P1 + P2 превысило критическое давление для активации более короткого рычага, соединенного с камерой A, чтобы позволить жидкости течь в камеру A. Затем, когда камеру B необходимо заполнить, нам нужно только применить P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) в основной камере, чтобы активировать длинный рычаг и позволить жидкости течь в камеру B. Можно ясно наблюдать, что между t = 3 с и 9 с жидкость в камере A оставалась постоянной, а в камере она увеличивалась.B при приложении давления P1.В то же время общее давление P1 + P2 превышает критическое давление, приводя в действие более короткий рычаг, соединяющий камеру А, позволяя жидкости течь в камеру А.Когда пришло время заполнить камеру А, мы просто применяем P1 в основной камере и P2 во вторичной камере.Таким образом, поведение потока можно выборочно переключать между камерами A и B. Поведение потока четырех многофункциональных режимов распределения можно найти в дополнительном фильме S2.
a Иллюстрация многофункционального назначения, т.е. (i) каскадного, (ii) одновременного, (iii) последовательного и (iv) выборочного назначения.Кривые представляют рабочий процесс и параметры этих четырех режимов распределения.b Результаты испытаний на длительное хранение в деионизированной воде и этаноле.Было проведено n = 5 независимых экспериментов, данные показаны как ± sd c.Демонстрации испытаний на стабильность, когда устройство FAST и устройство капиллярного клапана (CV) находились в (i) статическом и (ii) вибрационном состояниях.(iii) Зависимость объема от времени для устройств FAST и CV на различных угловых частотах.d Публикация результатов испытаний по запросу для (i) устройства FAST и (ii) устройства CV.(iii) Зависимость между объемом и временем для устройств FAST и CV, использующих прерывистый режим давления.Все масштабные линейки, 1 см.Необработанные данные предоставляются в виде файлов необработанных данных.
Долгосрочное хранение реагентов — еще одна важная особенность успешного устройства POCT, которое позволит неподготовленному персоналу работать с несколькими реагентами.Хотя многие технологии показали свой потенциал для длительного хранения (например, 35 микродиспенсеров, 48 блистерных упаковок и 49 стик-упаковок), для размещения упаковки требуется специальный приемный отсек, что увеличивает стоимость и сложность;кроме того, эти механизмы хранения не позволяют осуществлять дозирование по требованию и приводят к потере реагентов из-за их остатков в упаковке.Возможность длительного хранения была проверена путем проведения ускоренного испытания на срок службы с использованием материала ПММА, обработанного на станке с ЧПУ, из-за его небольшой шероховатости и устойчивости к проникновению газа (дополнительный рисунок S5).Тестовый аппарат заполняли деионизированной водой (деионизированная вода) и 70% этанолом (имитирующим летучие реагенты) при температуре 65°С в течение 9 суток.И деионизированную воду, и этанол хранили с использованием алюминиевой фольги, чтобы заблокировать доступ сверху.Уравнение Аррениуса и энергия активации проникновения, описанные в литературе50,51, использовались для расчета эквивалента в реальном времени.На рис.3b показаны средние результаты потери веса для 5 образцов, хранившихся при 65°C в течение 9 дней, что эквивалентно 0,30% для деионизированной воды и 0,72% для 70% этанола в течение 2 лет при 23°C.
На рис.3c показано испытание на вибрацию.Поскольку капиллярный клапан (CV) является наиболее популярным методом манипуляции с жидкостью среди существующих устройств POCT28,29, для сравнения было использовано устройство CV шириной 300 мкм и глубиной 200 мкм.Видно, что когда оба устройства остаются неподвижными, жидкость в платформе FAST-POCT уплотняется, а жидкость в устройстве CV блокируется из-за внезапного расширения канала, что снижает капиллярные силы.Однако по мере увеличения угловой частоты орбитального вибратора жидкость на платформе FAST-POCT остается герметичной, но жидкость в устройстве CV течет в нижнюю камеру (см. также дополнительный фильм S3).Это говорит о том, что деформируемые шарниры платформы FAST-POCT могут прикладывать к модулю сильную механическую силу, чтобы плотно закрыть жидкость в камере.Однако в устройствах CV жидкость удерживается из-за баланса между твердой, воздушной и жидкой фазами, что создает нестабильность, а вибрации могут нарушить баланс и вызвать неожиданное поведение потока.Преимущество платформы FAST-POCT в том, что она обеспечивает надежную работу и позволяет избежать сбоев при наличии вибраций, которые обычно возникают при доставке и эксплуатации.
Еще одной важной особенностью платформы FAST-POCT является возможность ее выпуска по требованию, что является ключевым требованием для количественного анализа.На рис.3d сравнивает выпуск платформы FAST-POCT по требованию и устройства CV.Из рис.3d(iii) мы видим, что устройство FAST быстро реагирует на сигнал давления.При приложении давления к платформе FAST-POCT жидкость текла, когда давление было снято, поток немедленно прекращался (рис. 3d(i)).Такое действие можно объяснить быстрым упругим возвратом шарнира, который прижимает рычаг обратно к блоку, закрывая патронник.Однако жидкость продолжала течь в устройстве CV, что в конечном итоге привело к неожиданному объему жидкости примерно 100 мкл после сброса давления (рис. 3d (ii) и дополнительный фильм S4).Это можно объяснить исчезновением эффекта капиллярного закрепления при полном смачивании ЦВА после первой инъекции.
Возможность работы с жидкостями различной смачиваемости и вязкости в одном устройстве остается проблемой для приложений POCT.Плохая смачиваемость может привести к утечкам или другому неожиданному поведению потока в каналах, а для приготовления высоковязких жидкостей часто требуется вспомогательное оборудование, такое как вихревые смесители, центрифуги и фильтры 52 .Мы проверили связь между критическим давлением и свойствами жидкости (с широким диапазоном смачиваемости и вязкости).Результаты показаны в Таблице 1 и Видео S5.Видно, что в камере можно герметизировать жидкости различной смачиваемости и вязкости, а при приложении давления в соседнюю камеру переносить даже жидкости с вязкостью до 5500 сП, что позволяет обнаруживать образцы с высокими вязкость (т.е. мокрота, очень вязкая проба, используемая для диагностики респираторных заболеваний).
Объединив вышеупомянутые многофункциональные дозирующие устройства, можно разработать широкий спектр устройств POCT на базе FAST.Пример показан на рисунке 1. Установка содержит камеру предварительного хранения, камеру смешивания, реакционную камеру и камеру для отходов.Реагенты могут храниться в камере предварительного хранения в течение продолжительных периодов времени, а затем выгружаться в камеру смешивания.При правильном давлении смешанные реагенты можно избирательно переносить в камеру отходов или реакционную камеру.
Поскольку обнаружение ПЦР является золотым стандартом для обнаружения таких патогенов, как H1N1 и COVID-19, и включает в себя несколько этапов реакции, мы использовали платформу FAST-POCT для обнаружения ПЦР в качестве приложения.На рис.4 показан процесс ПЦР-тестирования с использованием платформы FAST-POCT.Сначала элюирующий реагент, реагент для магнитных микрошариков, промывной раствор A и промывной раствор W пипеткой наносили в камеры предварительного хранения E, M, W1 и W2 соответственно.Стадии адсорбции РНК показаны на рис.4а и заключаются в следующем: (1) при приложении давления P1 (=0,26 бар) образец перемещается в камеру М и выгружается в камеру смешивания.(2) Давление воздуха P2 (= 0,12 бар) подается через порт A, подключенный к нижней части смесительной камеры.Хотя ряд методов смешивания показали свой потенциал при смешивании жидкостей на платформах POCT (например, змеевиковое смешивание 53, случайное смешивание 54 и периодическое смешивание 55), их эффективность и результативность смешивания все еще не являются удовлетворительными.Он использует метод пузырькового смешивания, при котором воздух подается в нижнюю часть смесительной камеры для создания пузырьков в жидкости, после чего мощный вихрь может достичь полного смешивания за несколько секунд.Были проведены эксперименты по смешиванию пузырьков, результаты представлены на дополнительном рисунке S6.Видно, что при приложении давления 0,10 бар полное перемешивание занимает около 8 секунд.При увеличении давления до 0,20 бар полное смешивание достигается примерно за 2 секунды.Методы расчета эффективности смешивания представлены в разделе «Методы».(3) Используйте рубидиевый магнит для извлечения шариков, затем создайте давление P3 (= 0,17 бар) через порт P, чтобы переместить реагенты в камеру для отходов.На рис.4b,c показаны этапы промывки для удаления примесей из образца следующим образом: (1) Промывной раствор A из камеры W1 выпускается в камеру смешивания под давлением P1.(2) Затем выполните процесс смешивания пузырьков.(3) Промывной раствор А переносится в камеру для отработанной жидкости, а микрошарики в смесительной камере вытягиваются магнитом.Промывка W (рис. 4в) аналогична промывке А (рис. 4б).Следует отметить, что каждый этап промывки A и W выполнялся дважды.На рисунке 4d показаны этапы элюирования РНК из шариков;этапы элюирования и введения при смешивании такие же, как этапы адсорбции и промывания РНК, описанные выше.Когда реагенты для элюирования передаются в реакционную камеру ПЦР под давлением P3 и P4 (=0,23 бар), достигается критическое давление, необходимое для герметизации рукава реакционной камеры ПЦР.Аналогичным образом, давление P4 также помогает герметизировать проход в камеру для отходов.Таким образом, все реагенты для элюирования были равномерно распределены по четырем реакционным камерам ПЦР для инициации реакций мультиплексной ПЦР.Вышеуказанная процедура представлена в дополнительном фильме S6.
На этапе адсорбции РНК образец вводится во входное отверстие М и впрыскивается в смесительную камеру вместе с ранее хранившимся раствором гранул.После смешивания и удаления гранул реагенты распределяются в камеру отходов.На этапах промывки b и c введите в смесительную камеру различные предварительно сохраненные промывочные реагенты, а после смешивания и удаления шариков перенесите реагенты в камеру для отработанной жидкости.d Этап элюирования: после введения реагентов для элюирования, смешивания и экстракции гранул реагенты передаются в реакционную камеру ПЦР.Кривые показывают рабочий процесс и связанные с ним параметры различных этапов.Давление – это давление, оказываемое через отдельные камеры.Объем – объем жидкости в смесительной камере.Все масштабные линейки имеют размер 1 см.Необработанные данные предоставляются в виде файлов необработанных данных.
Была проведена процедура ПЦР-тестирования, и на дополнительном рисунке S7 представлены термические профили, включая 20 минут времени обратной транскрипции и 60 минут времени термоциклирования (95 и 60 ° C), причем один термический цикл составляет 90 с (дополнительный фильм S7)..FAST-POCT требует меньше времени для завершения одного термического цикла (90 секунд), чем обычный RT-PCR (180 секунд для одного термического цикла).Это можно объяснить высоким соотношением площади поверхности к объему и низкой тепловой инерцией реакционной камеры микро-ПЦР.Поверхность камеры составляет 96,6 мм2, а объем камеры — 25 мм3, что соответствует соотношению поверхности к объему примерно 3,86.Как видно на дополнительном рисунке S10, тестовая зона ПЦР нашей платформы имеет канавку на задней панели, благодаря чему дно камеры ПЦР имеет толщину 200 мкм.К нагревательной поверхности терморегулятора прикреплена теплопроводящая эластичная прокладка, обеспечивающая плотный контакт с задней частью испытательного бокса.Это снижает тепловую инерцию платформы и повышает эффективность обогрева/охлаждения.Во время термоциклирования парафин, встроенный в платформу, плавится и течет в реакционную камеру ПЦР, действуя как герметик, предотвращая испарение реагента и загрязнение окружающей среды (см. Дополнительный фильм S8).
Все описанные выше процессы ПЦР-детектирования были полностью автоматизированы с использованием изготовленного на заказ прибора FAST-POCT, состоящего из блока программного контроля давления, блока магнитной экстракции, блока контроля температуры и блока захвата и обработки флуоресцентного сигнала.Следует отметить, что мы использовали платформу FAST-POCT для выделения РНК, а затем использовали извлеченные образцы РНК для реакций ПЦР, используя систему FAST-POCT и настольную систему ПЦР для сравнения.Результаты были почти такими же, как показано на дополнительном рисунке S8.Оператор выполняет простую задачу: вводит образец в М-камеру и вставляет платформу в прибор.Количественные результаты теста будут доступны примерно через 82 минуты.Подробную информацию об инструментах FAST-POCT можно найти на дополнительном рисунке.С9, С10 и С11.
Грипп, вызываемый вирусами гриппа А (IAV), B (IBV), C (ICV) и D (IDV), является распространенным глобальным явлением.Из них IAV и IBV являются причиной наиболее тяжелых случаев и сезонных эпидемий, заражая 5–15% населения мира, вызывая 3–5 миллионов тяжелых случаев и вызывая 290 000–650 000 смертей ежегодно.Респираторные заболевания56,57.Ранняя диагностика ИАВ и ИБ имеет важное значение для снижения заболеваемости и связанного с ней экономического бремени.Среди доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) считается наиболее чувствительной, специфичной и точной (>99%)58,59.Среди доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) считается наиболее чувствительной, специфичной и точной (>99%)58,59.Среди доступных диагностических методов наиболее чувствительной, специфичной и точной (>99%) считается полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР)58,59.Среди доступных методов диагностики полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) считается наиболее чувствительной, специфичной и точной (>99%)58,59. Из доступных диагностических методов наиболее чувствительной, специфичной и точной (>99%) считается полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР)58,59.Из доступных методов диагностики полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) считается наиболее чувствительной, специфичной и точной (>99%)58,59.Однако традиционные методы RT-PCR требуют многократного пипетирования, смешивания, дозирования и переноса жидкости, что ограничивает их использование профессионалами в условиях ограниченных ресурсов.Здесь платформа FAST-POCT использовалась для ПЦР-обнаружения IAV и IBV соответственно, чтобы получить их нижний предел обнаружения (LOD).Кроме того, IAV и IBV были мультиплексированы для различения различных патотипов у разных видов, что обеспечивает многообещающую платформу для генетического анализа и возможность точного лечения заболевания.
На рис.5а показаны результаты ПЦР-тестирования ВГА с использованием в качестве образца 150 мкл очищенной вирусной РНК.На рис.5а(и) видно, что при концентрации ВГА 106 копий/мл интенсивность флуоресценции (ΔRn) может достигать 0,830, а при снижении концентрации до 102 копий/мл ΔRn все еще может достигать 0,365, что соответствует более высокой, чем у группы пустого отрицательного контроля (0,002), примерно в 100 раз выше.Для количественной оценки на основе шести независимых экспериментов была построена линейная калибровочная кривая между логарифмической концентрацией и порогом цикла (Ct) IAV (рис. 5a(ii)), R2 = 0,993, в диапазоне 102-106 копий/мл.результаты хорошо согласуются с традиционными методами RT-PCR.На рис.5a(iii) показаны флуоресцентные изображения результатов испытаний после 40 циклов использования платформы FAST-POCT.Мы обнаружили, что платформа FAST-POCT может обнаруживать ВГА всего в 102 копиях/мл.Однако традиционный метод не имеет значения Ct 102 копий/мл, что делает его LOD около 103 копий/мл.Мы предположили, что это может быть связано с высокой эффективностью перемешивания пузырьков.Тестовые эксперименты ПЦР проводились на очищенной РНК IAV для оценки различных методов смешивания, включая перемешивание встряхиванием (тот же метод смешивания, что и при обычной операции RT-PCR), смешивание во флаконах (этот метод, 3 секунды при давлении 0,12 бар) и отсутствие смешивания в качестве контрольной группы. ..Результаты можно найти на дополнительном рисунке S12.Видно, что при более высокой концентрации РНК (106 копий/мл) значения Ct различных методов смешивания практически такие же, как и при пузырьковом смешивании.Когда концентрация РНК упала до 102 копий/мл, встряхиваемая смесь и контрольная смесь не имели значений Ct, тогда как метод пузырьковой смеси по-прежнему давал значение Ct 36,9, что было ниже порога Ct, равного 38. Результаты показывают доминирующую характеристику смешивания. везикул, что также было продемонстрировано в другой литературе, что также может объяснить, почему чувствительность платформы FAST-POCT немного выше, чем обычная RT-PCR.На рис.5б представлены результаты ПЦР-анализа очищенных образцов РНК ИБК в диапазоне от 101 до 106 копий/мл.Результаты были аналогичны тесту IAV: R2 = 0,994 и LOD 102 копий/мл.
ПЦР-анализ вируса гриппа А (IAV) с концентрациями IAV от 106 до 101 копий/мл с использованием буфера TE в качестве отрицательного контроля (NC).(i) Кривая флуоресценции в реальном времени.(ii) Линейная калибровочная кривая между логарифмической концентрацией РНК IAV и порогом цикла (Ct) для FAST и традиционных методов тестирования.(iii) Флуоресцентное изображение IAV FAST-POCT после 40 циклов.б — ПЦР-обнаружение вируса гриппа В (IBV) с (i) спектром флуоресценции в реальном времени.(ii) Линейная калибровочная кривая и (iii) флуоресцентное изображение FAST-POCT IBV после 40 циклов.Нижний предел обнаружения (LOD) IAV и IBV с использованием платформы FAST-POCT составил 102 копии/мл, что ниже, чем у традиционных методов (103 копии/мл).c Результаты мультиплексного теста на IAV и IBV.GAPDH использовали в качестве положительного контроля, а буфер TE использовали в качестве отрицательного контроля для предотвращения возможного загрязнения и фоновой амплификации.Можно выделить четыре различных типа образцов: (1) отрицательные образцы только по GAPDH («IAV-/IBV-»);(2) IAV-инфекция («IAV+/IBV-») IAV и GAPDH;(3) инфекция IBV («IAV-/IBV+») с IBV и GAPDH;(4) Инфекция IAV/IBV («IAV+/IBV+») с IAV, IBV и GAPDH.Пунктирная линия представляет собой пороговую линию.Проведено n = 6 биологически независимых экспериментов, данные представлены в виде ± стандартное отклонение.Необработанные данные представлены в виде файлов необработанных данных.
На рис.5c показаны результаты теста мультиплексирования для IAV/IBV.Здесь в качестве раствора образца использовался вирусный лизат вместо очищенной РНК, а четыре праймера для IAV, IBV, GAPDH (положительный контроль) и буфера TE (отрицательный контроль) были добавлены в четыре различные реакционные камеры платформы FAST-POCT.Здесь используются положительные и отрицательные контроли для предотвращения возможного загрязнения и усиления фона.Тесты были разделены на четыре группы: (1) GAPDH-отрицательные образцы («IAV-/IBV-»);(2) инфицированные IAV («IAV+/IBV-») по сравнению с IAV и GAPDH;(3) ИБВ-.инфицированные («IAV-»)-/IBV+») IBV и GAPDH;(4) Инфекция IAV/IBV («IAV+/IBV+») IAV, IBV и GAPDH.На рис.5в видно, что при нанесении отрицательных образцов интенсивность флуоресценции ΔRn камеры положительного контроля составляла 0,860, а ΔRn IAV и IBV была аналогична отрицательному контролю (0,002).Для групп IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ и IAV+/IBV+ камеры IAV/GAPDH, IBV/GAPDH и IAV/IBV/GAPDH показали значительную интенсивность флуоресценции соответственно, в то время как другие камеры даже показали интенсивность флуоресценции на фоне. уровень 40 после термоциклирования.Судя по приведенным выше тестам, платформа FAST-POCT показала выдающуюся специфичность и позволила нам одновременно патотипировать различные вирусы гриппа.
Чтобы подтвердить клиническую применимость FAST-POCT, мы протестировали 36 клинических образцов (образцы мазков из носа) от пациентов с ИБ (n = 18) и контрольной группы без ИБ (n = 18) (рис. 6a).Информация о пациентах представлена в дополнительной таблице 3. Инфекционный статус ИБ был независимо подтвержден, а протокол исследования был одобрен Первой дочерней больницей Университета Чжэцзян (Ханчжоу, Чжэцзян).Каждая выборка пациентов была разделена на две категории.Один из них был обработан с использованием FAST-POCT, а другой — с использованием настольной системы ПЦР (SLAN-96P, Китай).В обоих анализах используются одни и те же наборы для очистки и обнаружения.На рис.6b показаны результаты FAST-POCT и обычной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).Мы сравнили интенсивность флуоресценции (FAST-POCT) с -log2(Ct), где Ct — порог цикла для обычной RT-PCR.Между этими двумя методами наблюдалось хорошее согласие.FAST-POCT и RT-PCR показали сильную положительную корреляцию со значением коэффициента Пирсона (r) 0,90 (рис. 6b).Затем мы оценили диагностическую точность FAST-POCT.Распределение интенсивности флуоресценции (FL) для положительных и отрицательных образцов было предоставлено в качестве независимого аналитического показателя (рис. 6в).Значения FL были значительно выше у пациентов с ИБ, чем в контрольной группе (****P = 3,31 × 10-19; двусторонний t-критерий) (рис. 6г).Затем были построены кривые рабочих характеристик приемника IBV (ROC).Мы обнаружили, что точность диагностики была очень хорошей, с площадью под кривой 1 (рис. 6д).Обратите внимание, что из-за обязательного заказа масок в Китае из-за COVID-19 с 2020 года мы не выявили пациентов с ВЗК, поэтому все положительные клинические образцы (т. е. образцы мазков из носа) были предназначены только для ИБК.
Дизайн клинического исследования.Всего было проанализировано 36 образцов, включая 18 образцов пациентов и 18 контрольных образцов, не связанных с гриппом, с использованием платформы FAST-POCT и традиционной RT-PCR.b Оцените аналитическую согласованность между FAST-POCT PCR и обычной RT-PCR.Результаты имели положительную корреляцию (Pearson r = 0,90).в Уровни интенсивности флуоресценции у 18 пациентов с ИБ и 18 контрольной группы.г У больных ИБ (+) значения FL были достоверно выше, чем в контрольной группе (-) (****P = 3,31 × 10-19; двусторонний t-критерий; n = 36).Для каждого квадратного графика черный маркер в центре представляет медиану, а нижняя и верхняя линии рамки представляют 25-й и 75-й процентили соответственно.Усы простираются до минимальной и максимальной точек данных, которые не считаются выбросами.е ROC-кривая.Пунктирная линия d представляет пороговое значение, оцененное на основе ROC-анализа.AUC для IBV равна 1. Необработанные данные предоставляются в виде файлов необработанных данных.
В этой статье мы представляем FAST, который обладает характеристиками, необходимыми для идеального POCT.К преимуществам нашей технологии относятся: (1) Универсальное дозирование (каскадное, одновременное, последовательное и избирательное), выпуск по требованию (быстрый и пропорциональный сброс приложенного давления) и надежная работа (вибрация при 150 градусах) (2) длительное хранение. (2 года ускоренного тестирования, потеря веса около 0,3%);(3) возможность работы с жидкостями с широким диапазоном смачиваемости и вязкости (вязкость до 5500 сП);(4) Экономичность (ориентировочная стоимость устройства FAST-POCT PCR составляет примерно 1 доллар США).Путем объединения многофункциональных дозаторов была продемонстрирована и применена интегрированная платформа FAST-POCT для ПЦР-обнаружения вирусов гриппа А и В.FAST-POCT занимает всего 82 минуты.Клинические испытания с 36 образцами мазков из носа показали хорошее соответствие интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Клинические испытания с 36 образцами мазков из носа показали хорошее соответствие интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Клинические тесты с 36 образцами глаз с хорошим соответствием интенсивности флуоресценции ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Клинические испытания с 36 образцами мазков из носа показали хорошее соответствие интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9). ОТ-ПЦР. Клинические испытания 36 образцов мазков из ношения показали хорошее совпадение интенсивности флуоресценции с уровнем ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).Клинические испытания 36 образцов мазков из носа показали хорошее соответствие интенсивности флуоресценции со стандартной ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).Параллельно с этой работой различные новые биохимические методы (например, термоциклирование плазмы, иммуноанализы без амплификации и анализы функционализации нанотел) показали свой потенциал в ПОКТ.Однако из-за отсутствия полностью интегрированной и надежной платформы POCT эти методы неизбежно требуют отдельных процедур предварительной обработки (например, выделения РНК44, инкубации45 и промывки46), что дополнительно дополняет текущую работу с этими методами для реализации расширенных функций POCT с необходимые параметры.производительность вывода в ответ.В этой работе, хотя воздушный насос, используемый для активации клапана FAST, достаточно мал, чтобы его можно было интегрировать в настольный прибор (рис. S9, S10), он все же потребляет значительную мощность и создает шум.В принципе, пневматические насосы меньшего форм-фактора можно заменить другими способами, такими как использование электромагнитной силы или приведение в действие пальцем.Дальнейшие улучшения могут включать, например, адаптацию наборов для различных и специфических биохимических анализов, использование новых методов обнаружения, которые не требуют систем нагрева/охлаждения, обеспечивая тем самым не требующую инструментов платформу POCT для приложений ПЦР.Мы считаем, что, учитывая, что платформа FAST обеспечивает возможность манипулирования жидкостями, мы считаем, что предлагаемая технология FAST представляет собой потенциал для создания общей платформы не только для биомедицинских испытаний, но также для мониторинга окружающей среды, тестирования качества пищевых продуктов, синтеза материалов и лекарств. ..
Сбор и использование образцов мазков из носа человека были одобрены Комитетом по этике Первой дочерней больницы Чжэцзянского университета (IIT20220330B).Было собрано 36 образцов мазков из носа, в том числе 16 взрослых <30 лет, 7 взрослых>40 лет, 19 мужчин и 17 женщин.Было собрано 36 образцов мазков из носа, в том числе 16 взрослых <30 лет, 7 взрослых>40 лет, 19 мужчин и 17 женщин.Было собрано 36 образцов мазков из носки, в которых приняли участие 16 взрослых < 30 лет, 7 взрослых старше 40 лет, 19 мужчин и 17 женщин.Тридцать шесть образцов мазков из носа были взяты у 16 взрослых <30 лет, 7 взрослых старше 40 лет, 19 мужчин и 17 женщин..Демографические данные представлены в дополнительной таблице 3. От всех участников было получено информированное согласие.У всех участников было подозрение на грипп, и они прошли тестирование добровольно и без компенсации.
Основание и крышка FAST изготовлены из полимолочной кислоты (PLA) и напечатаны на 3D-принтере Ender 3 Pro (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).Двустороннюю ленту покупали у Adhesives Research, Inc., модель 90880. ПЭТ-пленку толщиной 100 мкм покупали у McMaster-Carr.Как клей, так и ПЭТ-пленка были разрезаны с помощью резака Silhouette Cameo 2 от компании Silhouette America, Inc. Эластичная пленка изготовлена из материала ПДМС методом литья под давлением.Сначала ПЭТ-рамка толщиной 200 мкм была вырезана с помощью лазерной системы и приклеена к листу ПММА толщиной 3 мм с помощью двусторонней клейкой ленты толщиной 100 мкм.Затем в форму выливали предшественник ПДМС (Sylgard 184; Часть А: Часть В = 10:1, Dow Corning) и использовали стеклянную палочку для удаления избытка ПДМС.После отверждения при 70°С в течение 3 часов пленку ПДМС толщиной 300 мкм можно было снять с формы.
Фотографии для универсального распространения, публикации по запросу и надежной работы делаются высокоскоростной камерой (Sony AX700, 1000 кадров в секунду).Орбитальный шейкер, использованный в тесте на надежность, был приобретен у SCILOGEX (SCI-O180).Давление воздуха создается воздушным компрессором, а для регулировки значения давления используются несколько цифровых прецизионных регуляторов давления.Процесс тестирования поведения потока заключается в следующем.В испытательное устройство вводили заданное количество жидкости и использовали высокоскоростную камеру для регистрации поведения потока.Затем из видеороликов поведения потока в фиксированное время были взяты неподвижные изображения, а оставшаяся площадь была рассчитана с помощью программного обеспечения Image-Pro Plus, которое затем было умножено на глубину камеры для расчета объема.Подробную информацию о системе тестирования поведения потока можно найти на дополнительном рисунке S4.
Введите 50 мкл микрогранул и 100 мкл деионизированной воды в устройство для смешивания флаконов.Фотографии смешанных характеристик делались высокоскоростной камерой каждые 0,1 секунды при давлении 0,1 бар, 0,15 бар и 0,2 бар.Информацию о пикселях в процессе смешивания можно получить из этих изображений с помощью программного обеспечения для обработки фотографий (Photoshop CS6).Эффективность смешивания можно достичь с помощью следующего уравнения 53.
где M — эффективность смешивания, N — общее количество пикселей образца, а ci и \(\bar{c}\) — нормализованная и ожидаемая нормализованная концентрации.Эффективность смешивания находится в диапазоне от 0 (0%, несмешанный) до 1 (100%, полностью смешанный).Результаты показаны на дополнительном рисунке S6.
Набор для ОТ-ПЦР в реальном времени для IAV и IBV, включая образцы РНК IAV и IBV (кат. номер RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, Китай), буфер Tris-EDTA (буфер TE, номер B541019). , Sangon Biotech, Китай), набор для очистки РНК положительного контроля (номер детали Z-ME-0010, Liferiver, Китай) и раствор GAPDH (номер детали M591101, Sangon Biotech, Китай) коммерчески доступны.Набор для очистки РНК включает буфер для связывания, промывку A, промывку W, элюент, магнитные микрогранулы и акриловый носитель.Наборы для ОТ-ПЦР в реальном времени IAV и IBV включают смесь для обнаружения нуклеиновых кислот IFVA и фермент ОТ-ПЦР.Добавьте 6 мкл AcrylCarrier и 20 мкл магнитных шариков к 500 мкл буферного раствора для связывания, хорошо встряхните и затем приготовьте раствор шариков.Добавьте к промывкам A и W по 21 мл этанола, хорошо встряхните, чтобы получить растворы промывателей A и W соответственно.Затем 18 мкл смеси флуоресцентной ПЦР с нуклеиновой кислотой IFVA и 1 мкл фермента RT-PCR добавляли к 1 мкл раствора TE, встряхивали и центрифугировали в течение нескольких секунд, получая 20 мкл праймеров IAV и IBV.
Выполните следующую процедуру очистки РНК: (1) Адсорбция РНК.Внесите 526 мкл раствора осадка в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 150 мкл образца, затем вручную встряхните пробирку вверх и вниз 10 раз.Перенесите 676 мкл смеси в аффинную колонку и центрифугируйте при 1,88×104 г в течение 60 секунд.Последующие дренажи затем выбрасываются.(2) Первый этап стирки.Добавьте 500 мкл промывочного раствора А в аффинную колонку, центрифугируйте при 1,88 x 104 г в течение 40 с и выбросьте отработанный раствор.Этот процесс промывания повторяли дважды.(3) второй этап промывки.Добавьте 500 мкл промывочного раствора W в аффинную колонку, центрифугируйте при 1,88×104 г в течение 15 с и отработавший раствор выбросьте.Этот процесс промывания повторяли дважды.(4) Элюирование.Добавьте 200 мкл элюата в аффинную колонку и центрифугируйте при 1,88 х 104 г в течение 2 мин.(5) ОТ-ПЦР: элюат вводили в 20 мкл раствора праймера в пробирке для ПЦР, затем пробирку помещали в испытательный аппарат для ПЦР в реальном времени (SLAN-96P) для проведения процесса ОТ-ПЦР.Весь процесс обнаружения занимает примерно 140 минут (20 минут для очистки РНК и 120 минут для обнаружения ПЦР).
Предварительно добавляли 526 мкл раствора гранул, 1000 мкл промывочного раствора A, 1000 мкл промывного раствора W, 200 мкл элюата и 20 мкл раствора праймера и хранили в камерах M, W1, W2, E и камерах обнаружения ПЦР.Платформа в сборе.Затем 150 мкл образца было помещено пипеткой в камеру M, а платформа FAST-POCT была вставлена в испытательный прибор, показанный на дополнительном рисунке S9.Примерно через 82 минуты результаты теста были доступны.
Если не указано иное, все результаты испытаний представлены как среднее значение ± стандартное отклонение после как минимум шести повторов с использованием только платформы FAST-POCT и биологически независимых образцов.Никакие данные не были исключены из анализа.Эксперименты не случайны.Во время эксперимента исследователи не были слепы к групповым задачам.
Для получения дополнительной информации о дизайне исследования см. аннотацию отчета о природных исследованиях, связанную с этой статьей.
Данные, подтверждающие результаты этого исследования, доступны в дополнительной информации.В этой статье приведены исходные данные.
Чагла, З. и Мадукар, П. Бустеры от COVID-19 в богатых странах задержат вакцинацию для всех.Чагла, З. и Мадукар, П. Бустеры от COVID-19 в богатых странах задержат вакцинацию для всех.Чагла З. и Мадукар П. Бустеры от COVID-19 в богатых странах задержат вакцинацию для всех.Чагла З. и Мадукар П. Ревакцинация против COVID-19 в богатых странах приведет к задержке вакцинации для всех.Национальная медицина.27, 1659–1665 (2021).
Фауст Л. и др.Тестирование на SARS-CoV-2 в странах с низким и средним уровнем дохода: наличие и доступность в частном секторе здравоохранения.микробная инфекция.22, 511–514 (2020).
Всемирная организация здравоохранения.Глобальная распространенность и заболеваемость отдельными излечимыми инфекциями, передающимися половым путем: обзор и оценки.Женева: ВОЗ, WHO/HIV_AIDS/2 https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/66818/WHO_HIV_AIDS_2001.02.pdf (2001).
Фентон, Э.М. и др.Несколько 2D-отформованных тест-полосок с боковым потоком.Приложение АСС.альма-матер.Интер Милан.1, 124–129 (2009).
Шиллинг, К.М. и др.Полностью закрытое микрофлюидное устройство для анализа на бумажной основе.анус.Химический.84, 1579–1585 (2012).
Лапентер Н. и др.Конкурирующая иммунохроматография на бумажной основе в сочетании с модифицированными ферментами электродами позволяет осуществлять беспроводной мониторинг и электрохимическое определение котинина в моче.Датчики 21, 1659 (2021).
Чжу, X. и др.Количественная оценка биомаркеров заболеваний с помощью универсальной латеральной жидкостной платформы, интегрированной с нанозимами, с использованием глюкометра.биологический сенсор.Биоэлектроника.126, 690–696 (2019).
Бу, С. и др.Тест-полоска на беременность для обнаружения патогенных бактерий с использованием гибридных наноцветков конканавалин А, хорионического гонадотропина человека и Cu3(PO4)2, магнитной сепарации и считывания данных со смартфона.Микрокомпьютер.Журнал.185, 464 (2018).